有經驗的科研伙伴們一定知道，在做反轉錄PCR實驗時，想要讓反轉錄順利進行，并且得出好看漂亮的擴增曲線，去除RNA中的雜質是必不可少的一個步驟，今天小朗就來帶大家一起了解下關于反轉錄中雜質的那些事兒......
反轉錄是什么
反轉錄是以RNA為模板，根據堿基互補配對原則合成DNA的過程，是對中心法則的重要修正和補充。
遺傳信息傳遞的中心法則
中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質，即完成遺傳信息的轉錄和翻譯的過程。這是所有有細胞結構的生物所遵循的法則。
逆轉錄和反轉錄的本質區別在于：反轉錄是人工合成DNA的過程，逆轉錄是RNA病毒自主形成DNA的過程。前者發生在體外，后者發生在體內。所以我們實驗中發生的是反轉錄。
反轉錄反應的示意圖如下圖所示：
雜質的種類和測定方法
想要知道RNA模板中是否存在雜質以及雜質的種類，可以利用Beer-Lambert定律通過測定其對特定波長的紫外光吸收度而確定。
朗伯比爾定律(Lambert-Beer law)是分光光度法的基本定律，是描述物質對某一波長光吸收的強弱與吸光物質的濃度及其液層厚度間的關系。
純的RNA A260/280在1.9-2.0之間，不同波長的吸光度比值可以確定是否存在特定污染物（表1）。請注意，紫外吸光度不是RNA特有的，所有核酸都可以吸收相近波長的紫外線。
波長 | 表明存在 | 目標比值 |
230 nm | 有機化合物，糖，尿素，鹽 | A260/A230 > 1.8 |
260 nm | 所有核酸 | A260 ≈ 0.1–1.0 |
270 nm | 苯酚 | A260/ A270 > 1.0 |
280 nm | 蛋白質 | RNA: A260/A280 ≈ 2.0 |
330 nm | 光散射 | A330 = 0 |
表1
雜質的影響和去除方法
以上我們通過不同波長的吸光度比值來確定了有哪些雜質存在于RNA模板中。那么這些雜質中有哪些會對RNA提取影響比較大，又要怎樣去除呢，一起來看下吧～
RNA純化過程中會混入鹽、金屬離子、乙醇、苯酚、SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等，均是常見的逆轉錄酶抑制劑，會大大影響反轉錄實驗的進行。
去除方法：
可將已確定的高質量RNA模板同樣品混合，同高質量 RNA模板比較產量以檢測RNA抑制劑；若高質量模板RNA與樣品混合后產量降低，則說明樣品中存在逆轉錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對RNA沉淀進行清洗，以除去抑制劑。
多糖——抑制逆轉錄酶活性
多糖的污染是影響RNA提取質量的重要因素之一，能抑制逆轉錄酶的活性[1]；因多糖的許多理化性質與RNA相似，所以在提取RNA的過程中很難將它與RNA分開，去除多糖的同時RNA也會被除去，從而導致RNA產量減少。
去除方法：
目前，去除多糖的方法主要有醋酸鈉沉淀法、LiCl沉淀RNA法、高濃度Na+或K+沉淀RNA法、低濃度乙醇沉淀法等[2]。
蛋白質也是污染RNA樣品的重要因素。由于多酚氧化酶和RNase均為蛋白質，因此要獲得高質量的RNA就必須有效地去除蛋白質。
去除方法：
常用RNA提取方法的CTAB法中的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）可有效地分離蛋白質，加入的SDS(十二烷基硫酸鈉)能與蛋白質螫合形成穩定化合物而除去蛋白質。常用RNA提取方法的Trizol法則是通過強蛋白變性劑異硫氰酸胍鹽和盧一巰基乙醇抑制RNase的活性。且在提取過程中，增加了氯仿抽提次數和使用水平衡酚進行抽提，氯仿可使蛋白質變性，有助于液相與有機相的分離，而水平衡酚能分離RNA，經過多次的離心，使RNA存在水相中而被分離出來。
總之，RNA的提取方法有多種，根據原材料的不同而選擇，不可避免會有各種不同的雜質存在，但提取過程中同時也會伴隨著RNA的降解現象發生。那么，污染和降解取得平衡，保證反轉錄反應順利進行，擴增出目的基因，才是我們最主要的實驗任務。
